五金农药在全球农业生产中是一把双刃剑，在大幅提高产量的同时，也带来残留问题，对生态系统和人类健康造成严重威胁。随着生活水平的提高及毒理学研究的日益完善，农药残留限量标准越发严格和详细，我国10 年内进行了5 次修订，限量数目从2 293 项增加至10 092 项，导致农残检测的样品量骤增，工作量加大，因此建立快速、简单、便捷的检测方法至关重要。

　　为了高效构建农药残留快速检测新方法，西北农林科技大学食品科学与工程学院的李艳青、宗欣荣、张敏*等从以下两个部分进行综述：第1部分从ePADs制备工艺出发，探究纸的选择、亲疏水通道的建立、分离区及检测区电极的制备方法，详细总结了ePADs每一环节的关键控制点；第2部分基于农药的电化学检测原理（直接检测、酶抑制、免疫法），建立农药检测与芯片制备之间的联系。最后进行展望，以期为ePADs检测农药残留的后续研究提供参考。

　　ePADs以纸为基底，通过毛细管力操纵流体流动。ePADs有多种制备方法，通常包括4 个环节（图2）：首先选择合适的纸，其次在纸上制备亲疏水通道以控制流体的流动，然后创建分离区，最后制备电极以进行分析物的电化学检测。根据所制备设备的复杂性，亲疏水通道的建立和电极的制备两个步骤可以调换。

　　随着人们对即时检测（POCT）、经济效益和环保方面的需求加强，以纸为基底的检测系统正得到日益广泛的关注和应用。纸的毛细管力使其在无需外力驱动的情况下即可引导液体流动，同时纸又具有一定的孔隙度，不仅可以储存试剂，而且能收集实际样品、预先浓缩分析物等。这些良好的特性使其成为POCT的理想平台。此外，纸可以通过微生物进行生物降解或焚烧以保护环境。尽管纸在ePADs的研究中已受到广泛关注，但纸种类繁多，增加了选择纸张类型的困难度。因此，总结常用纸的特点及文献中已有的用途至关重要。

　　ePADs常用的纸有滤纸、办公纸、硝酸纤维素膜等，表1总结了这些纸的微观结构及适用性。根据吸附性，可以将所有的纸分为高吸附型和低吸附型。高吸附型纸（如Whatman 1号滤纸）的优点是可以将部分试剂装载在纸张的纤维素结构中，使样品量需求量减少（5～10 μL）；低吸附型纸（如办公纸）的主要优点是制备的电极可以直接暴露在溶液中，检测灵敏度更高，但试剂不易装载在纸中。将不同类型纸的联用是提高ePADs功能特性的一种常用方法，例如Arduini等开发了一种用于检测不同类型农药的三维折纸多重ePADs，此设备由办公纸和滤纸组成，办公纸用来印刷电极，滤纸用来储存试剂，大大提高了便携性和灵敏性。

　　亲疏水通道的功能是控制流体在纸上的流动方向。选定纸的类型后，通过在纸上设计各种形状的疏水屏障，实现流体在纸上的定向流动。根据亲疏水通道制备过程中所用的疏水材料与纸张的结合状态，可将其分为物理改性、化学改性和切割成型（图3）。

　　物理改性包括物理填充纸的孔隙或在纤维表面沉积憎水化合物，这两种方式中憎水化合物与纤维素纤维之间不发生化学反应。常用的物理改性试剂有以下4 种。

　　蜡具有高疏水性和热诱导熔化性能，是一种合适的制备亲疏水通道的候选材料。基于蜡的沉积是一种简单和低成本的方法，可以沉积具有可重复性的疏水图案屏障。在这种方法中，先沉积蜡膜的表面图案，然后加热使蜡融化，从而浸渍下面的纤维素基材，形成三维疏水结构。然而，蜡在热处理过程中不可避免地会扩散，使划定的亲水通道缩小，并可能导致图案的变形。因此，控制加热温度和加热时间对制备高分辨率的通道至关重要，而温度和加热时间的控制取决于所用纸张的克重（纸张的面积密度）和孔隙度。

　　聚苯乙烯（PS）是一种廉价易得的疏水性聚合物。Sameenoi等将PS溶解在甲苯中，采用丝网印刷的方法制备疏水区域，PS和甲苯的混合溶液通过筛网浸透纸张，在甲苯蒸发后，疏水屏障仍然存在。

　　聚二甲基硅氧烷（PDMS）因其易于制造、透明、电导率和弹性低而成为微流控芯片研究中最受欢迎的聚合物。Dornelas等使用带有定制图案的橡胶印章将PDMS和正己烷的混合溶液轻轻压在色谱纸表面，30 s后混合物穿透色谱纸，将带有图案的色谱纸置于70 ℃条件下固化30 min形成疏水屏障，分辨率约1 mm。由于PDMS与一些有机溶剂相溶，包括一些醇类、腈类、二取代酰胺类、亚砜、吡啶等。因此，原则上利用PDMS制备ePADs是进行各种需要非水介质分析实验的首选。

　　光刻胶在光照或加热条件下极易发生交联反应形成不溶于水的高聚物，基于此，可将纸张衬底浸泡在光刻胶中以吸收光刻胶，并通过掩模将纸张暴露在所需的紫外光模式下形成屏障。透明膜上未被墨水保护的区域经紫外光照射后会成为疏水区，而透明膜上印有黑色墨水的区域会成为亲水通道，最后清洗去除纸张上未暴露在紫外光下的光刻胶。Zea等将SU-8光刻胶打印在Whatman 1号纸上制备亲疏水通道，并研究了打印层数对静态接触角值的影响，研究结果表明，当印刷层数为6时，疏水效果最好。

　　化学改性是通过一些能与纤维素上的羟基（—OH）反应的试剂，向纤维素分子链上引入疏水基团，从而形成亲疏水通道的方法。这意味着它与纸张的结合比仅依靠物理吸附的试剂更牢固，并且化学改性只是使纤维素网络更疏水，它仍允许具有相容表面能的液体继续通过，仅阻挡那些表面能与疏水试剂不匹配的液体。AKD和硅烷化试剂是常采用的化学改性试剂。

　　AKD是造纸工业中常用来调节纸制品疏水性的一种物质，由天然脂肪酸（14～22 个碳）制成，加热后与纤维素中的羟基形成化学键。AKD在商业上以固体薄片或乳液的形式出售。AKD乳液的保质期通常在几周到3 个月之间。AKD极易水解，AKD可以和水分子发生反应产生β-酮酸，其又会自发脱羧形成酮。这个缓慢的过程会导致AKD不能再与纤维素共价结合。因此，在AKD用量较低的情况下，建议现配现用。Deng Yafeng等将AKD喷墨打印在滤纸上，加热条件下与滤纸纤维中的羟基发生聚合反应形成疏水屏障。打印的区域疏水，未打印的区域仍保持亲水。实验中优化了AKD的配方和处理条件等因素，成功制备了边界清晰、传输速度快、成本低、效率高的纸基微流体芯片。并且此研究表明，使用AKD改性的成本很低，每平方米不足0.006 元。

　　三甲氧基十八烷基硅烷（TMOS）上的硅氧烷（Si—OR）不与滤纸纤维素上的—OH反应，但TOMS在水蒸气环境中能水解生成硅烷醇基团（Si—OH），通过Si—OH与—OH之间的反应可以将TMOS固定在纤维素上。同时，水解后的TOMS可以通过Si—OH的自由缩合相互连接，最后被固定在滤纸纤维上，并被疏水性基团覆盖。Cai Longfei等首先将具有特定图案的纸掩膜浸泡在TMOS-庚烷的混合溶液中30 s，取出风干置于玻璃载玻片上；然后依次将空白滤纸和另一块载玻片放上去；最后在加热板上100 ℃加热35 min以产生疏水效果。这种硅烷化制成的ePADs可以抵抗有机溶剂和表面活性剂的影响。

　　十三氟辛基三乙氧基硅烷（POTS）是一种双官能团化合物，含有的硅烷氧基官能团在水解后释放低分子醇，由此产生的活泼性硅醇能与许多无机和有机基材中的羟基、羧基和含氧基团产生化学键合。Zea等用POTS对纸进行疏水处理。气相硅烷化纸的静态接触角高于150°，说明有机硅烷与纸纤维素表面的羟基发生反应，从而产生疏水性。此过程简单，无需预处理和后期处理，在几分钟内就可以完成。然而，这种硅烷化的方使整张纸变得疏水，为制备想要的图案，常使用掩膜将其遮住以保证制备出所需的图案。

　　十八烷基三氯硅烷（OTS）作为一种流行的有机硅烷衍生物，可以改善纤维素纸的疏水性，克服纤维素纸的不足。Wang Hui等利用OTS制备了超疏水纤维素纸，提高了微流控场效应生物传感器的机械强度和较短的使用寿命，并开发了一种由半导体单壁碳纳米管和DNA酶组成的微流场效应生物传感器，可测定25～5 μmol/L范围内的Ca 2+ 浓度，检测限为10.7 μmol/L。通过化学改性制备的亲疏水通道具有不受有机溶剂影响的优势。

　　除了使用不同的疏水材料制备亲疏水通道，还可以直接切割成型纸基底制作ePADs。常用的切割工具有CO 2 激光切割刀、打孔机、工艺刀等。在这种情况下，纸被直接切割成所需的形状，并可以立即使用。但是由于纸张材料缺乏机械刚性，因此在大多数情况下会用胶布贴在纸的背面起支撑作用，使整个设备的结构更牢固。陈尧使用CO 2 切割设备在纸上制备了蛇形的微流控通道用于脱水提醒。切割成型的主要缺点是大规模生产中需要专门的设备，在资源有限的地区会受到限制。

　　分离区的目的是将待测样品进行预处理，去除杂质以提高待测物检测的准确性。尤其在实际样品的检测中，所面对的样品基质通常十分复杂，如不进行预处理，常难以满足检测需求。实验室常用的样品预处理技术往往操作繁琐且依赖昂贵设备，不适合现场快速检测。纸的多孔结构以及纸纤维素上的羟基和羧基等活性基团为现场快速检测中样品的前处理提供了新思路。基于此，研究学者利用纸自身的优势，在纸上建立了各种样品前处理的方法，根据分离原理可将其分为纸过滤、纸色谱和纸电泳。

　　纸过滤是利用纸的多孔结构吸附拦截杂质。例如，Santhiago等利用滤纸作为滤膜，制备了具有样品前处理效果的3D-ePADs，其原理是当待测样品通过滤纸时，杂质就留在滤纸上，目标物对硝基苯酚则通过滤纸流入检测区，从而实现了对硝基苯酚的灵敏电化学检测。为了提升纸过滤的效率，大量研究工作采用化学修饰方法对纸纤维素进行改性，如螯合、吸附、离子交换和纸固定相内的亲疏水相互作用等。如图4A所示，Li Shuhuai等在色谱纸上固定分子印迹聚合物（MIPs），当样品滴加到样品通道中，样品通过重力扩散并流经亲水通道到达反应区，样品中的甲基对硫磷被MIPs吸附，未吸附的组分继续流过反应区。MIPs选择性地吸附甲基对硫磷，同时使其他组分离开反应区，显著提高了芯片的选择性。该方法简单、廉价且便携性强。除此之外，如图4B所示，Shiroma等根据对乙酰氨基酚（PA）和对氨基苯酚（4-AP）pKa的差异（PA为9.8，4-AP为5.3），选择Whatman P81（一种高通量的强阳离子交换纸）构造分离装置，由于4-AP与纸上带有负电荷的官能团相互作用，导致其保留时间较长，通过这种方式达到分离效果。这些弱酸/弱碱之间峰的分辨率可以通过改变流动相的pH值进一步优化。

　　纸色谱又称为纸层析，是基于分析物与固定相和流动相之间相互作用的差异实现分析物分离或富集。如图4C所示，Primpray等使用乙酸乙酯和环己烷作流动相，将Whatman SG81纸切成矩形，两种待分离物和混合物分别和甲醇按一定的体积比混合，取适量涂抹在纸上，将纸放入色谱槽中，直到流动相的溶剂前段到达纸张的顶部，根据两种分析物在分离过程中分配系数的差异实现分离。

　　纸电泳是在纸的两端施加电压，带电分析物在电场作用下发生移动从而达到分离的目的。为了实现分离和检测一体，可以将电泳集成到ePADs中。如图4D所示，Liu Yingchao等将微流控自由流电泳与滤纸色谱相结合，通过改变分离环境的密度和运动黏度从而提高分离效率和分离系统的稳定性，实现了分析物的连续分离。微流控自由流动电泳是一种用于复杂混合物连续和高通量分离的通用技术。在微流控自由流动电泳中，分析物通过垂直施加的电场流动以实现连续分离。与传统的大规模分离方法相比，微流控自由流动电泳具有样品消耗少、驱动压力低、分离电压低、散热快等优点。

　　电极的制备是ePADs制备中最后一个重要步骤，将电化学传感器集成到微流控纸芯片上，即可实现样品的定性和定量分析。在大多数农药的检测中，ePADs上的电化学传感器通常由三电极系统组成，即工作电极、对电极和参比电极。如图5所示，常见的纸电极的制备方法有笔绘、丝网印刷/模板印刷、喷墨打印、CO2激光刻划、真空过滤等。

　　铅笔或钢笔绘图是一种在纸上制造电极简单快速的技术，常使用石墨笔或碳墨改性的钢笔。钢笔绘图时油墨需加热固化，铅笔绘图则不需要。Dossi等首次利用石墨铅笔在纸上制备工作电极和对电极。为了降低电极之间的批间差异，需要先在纸上用墨粉或铅笔画出轮廓，然后进行绘制。因为石墨是通过绘制直接转移到纸上的，所以不需要黏合剂，也不会像丝网印刷和模板印刷一样浪费碳浆。但是手绘电极的厚度不容易控制，电极的电导率容易受到影响。同样，一支含有特殊配方的碳或银墨水的笔可以用来在纸上绘制电极。Kare等最近报道了一种使用碳墨水改性钢笔手绘制备ePADs的快速方法，直接用钢笔画出参考线，将电极手绘在滤纸上。虽然铅笔和钢笔绘图操作简单，但手动绘制中施加的压力不容易控制，很大程度地影响了电极材料在纸上的沉积，导致电极重现性低，难以大规模生产。相比之下，Pagkali等通过计算机控制的XY绘图仪和铅笔将电极沉积在纸上，此方法施加的压力容易控制，随后评估了制备参数（纸张类型、记号笔类型、铅笔类型、绘图速度、遍数、单面和双面绘图）对电极的机械和分析性能的影响。

　　丝网印刷和模板印刷原理相同，两者的区别是丝网印刷需要定制精细的筛网，而模板印刷不需要。丝网印刷是最先报道的电极制造方法，也是目前最广泛使用的方法。油墨在刮板的压力作用下透过定制的网版被印刷到纸上，再将纸置于60～90 ℃的烘箱中加热固化，以形成所需要的导电图案。陈平研究了丝网印刷工艺中网版的制备、碳浆印刷等工艺过程对丝网印刷电极性能的影响，并确定了最佳的工艺条件，通过测定不同批次电极的电阻对电极进行表征，确定丝网印刷电极的质控方法。为了避免丝网印刷过程中需要专门定制的筛网问题，模板印刷利用透明胶带或其他固体薄膜设计图案作为掩膜，油墨透过掩膜的开口处施涂在纸上制备电极。掩膜板可以通过手工或激光切割制作。与丝网印刷相似，模板印刷后的电极油墨需要加热固化。为了在电极上获得清晰的边界，模板印刷所用的油墨通常比丝网印刷所用的油墨黏稠。

　　与上述两种印刷方法相比，喷墨打印是一种更通用的在纸上制备电极的方法。喷墨打印通过喷墨打印机将导电油墨自动打印到纸上，此方法可以使用多个墨盒同时打印多种材料，一次性印刷大量图案，并且不需要预沉积或模板。市面售卖的打印机可以被改造用来打印电极，不过还需投入更多的研究才能获得良好的效果。碳粉、碳纳米管、石墨烯纳米粉和银纳米粒子等常被用于在纸上喷墨打印电极。同时，这种方法也有一定的缺点，包括喷嘴堵塞和打印机成本高。为了防止喷嘴阻塞，喷墨打印所需的油墨必须具有较低的黏度，但这又会导致电极的导电性降低，因此，在制备电极过程中往往需要多层印刷以保证其导电性。

　　为了克服上述问题，另一种在纸上制造碳电极的自动化技术是CO 2 激光刻划。CO 2 激光可用于普通纸板表面的热解，以产生导电碳材料，用作电化学测量的电极。Martins等利用CO 2 激光热解制备ePADs，成功用于商业饮料中亚硫酸盐的方波伏安分析。激光刻划在制造过程中不涉及化学品的使用，所以比其他方法更环保，并且所制备的电极具有良好的可重复性和电化学性能。

　　真空过滤是通过在纸的一侧造成一定程度的负压（真空）而使导电油墨沉积在纸上制备电极的方法。Yu Haixiang等利用廉价塑料模板作为基本过滤装置，首先将单壁碳纳米管在真空条件下通过定制的模板过滤到滤纸基底上，以形成具有三电极图案的导电基底，随后再将金属纳米颗粒在真空条件下沉积到上述单壁碳纳米管图案纸上，形成金属膜。通过使用定制形状的模板，可以将不同的金属纳米颗粒沉积到同一张纸上，形成不同材料、厚度和形状的电极。该过程简单、快速、经济，三电极系统的材料、形状、尺寸、厚度可以完全定制，并且不需要耗时的沉积过程或复杂的仪器。

　　除了上述常用的制备方法外，还有一些方法，如微细线植入、溅射、滴涂、滴铸等。其中微线植入是将金属电极黏接到纸基微流控芯片上，而溅射技术需要一个专门的溅射室，成本很高。

　　电化学传感器为农药残留的检测提供了一种有前景的方法。电化学传感器基本都是由识别系统和转换系统两部分组成，其基本原理为目标物质与感应元件接触后传出感应信号，经过转换系统转换为电信号，再通过电化学工作站进行处理和信号放大，进而对目标物质进行定性或定量分析。采用ePADs检测农药的研究有很多，基于电化学检测原理，检测农残的ePADs可分为以下4 类。

　　电活性基团是指能在电极上发生氧化还原反应的官能团，通常包括卤素（X）、硝基（—NO 2 ）、氨基（—NH 2 ）、—OH等。由于部分农药分子或其降解产物中含有这些基团，因此极易在工作电极上发生氧化还原反应，从而产生电化学响应信号。部分研究人员正是利用这一特点对食品或环境中残留的农药分子进行直接、快速的电化学检测。本课题组目前也正对自身或其水解产物中含有电活性基团的农药直接检测方法进行积极研究，希望开发出更加灵敏、简便、检测限更低的检测方法。表2总结了基于电活性基团的ePADs检测方法。例如甲基对硫磷分子中含有—NO 2 ，因此可以用ePADs直接检测。

　　基于酶的电化学检测是通过测量酶的抑制程度、传感器活性和检测下限从而确定所测样品中农药的浓度。该方法是无电活性农药电化学检测的常用策略之一。表3总结了基于酶抑制的ePADs检测农药残留情况。酶的固定是制备ePADs的关键步骤。例如Dabhade等将纸作为酶固定的平台，研究了壳聚糖、海藻酸钠和葡聚糖3 种多糖在滤纸上固定葡萄糖氧化酶的方法，发现壳聚糖的酶包封效率最高（约90%），且稳定性最好（约97%）。该研究最后以壳聚糖为包埋剂，将葡萄糖氧化酶固定在滤纸上，并将其与丝网印刷电极相结合，制备了一种ePADs。农药检测是通过计时电流法测量无农药条件下初始酶活性和暴露于农药溶液后的残余酶活性，并评估与喷雾农药量呈正比的抑制百分比进行的。此传感器能够在气溶胶阶段检测3 类农药，2,4-D、草甘膦和对氧磷检测限分别为30、10 μg/L和2 μg/L。这些结果说明，酶与ePADs结合的传感平台检测灵敏度更高，能够在农药检测领域发挥更大的作用。

　　基于免疫的电化学检测是指以抗体为识别元件的检测策略，具有检测灵敏度高的特点。农药作为小分子化合物自身不具有完全免疫原性，需要和蛋白质等大分子化合物结合以获得完全免疫原性。基于抗原或抗体的专一性进而识别检测样品中的抗原抗体。在农药残留检测中，需要人工合成相应的农药抗体，从而实现对农药残留的高灵敏检测。Ruan Xiaofan等利用3D打印技术设计了一种多重免疫传感器，用于同时检测两种广泛使用的除草剂莠去津和乙草胺。通过定制侧流免疫分析，实现了多路复用，然后与电化学分析仪集成，用于超灵敏农药检测。

　　除了天然抗体外，人工抗体与ePADs结合的设备近年来也备受关注。人工抗体是自然生物抗体-抗原体系类似合成物，即MIPs。目前，基于MIPs的ePADs已广泛应用于检测糖蛋白、炎症蛋白、甲基对硫磷等。与天然抗体易受温度和pH值的影响相比，MIPs具有良好的稳定性，可以长期储存，并且不需要特殊的储存条件和温度范围。

　　除上述外，一些研究中还使用细菌的细胞（如大肠杆菌）和线粒体作为农药检测的生物识别元素。已有研究表明，线粒体电子传递链包含电化学活性物质醌，醌能在工作电极上发生反应产生电化学信号。而对于大多数农药而言，线粒体是它们的主要或次要目标，因此线粒体生物传感器不仅可以检测有机磷类（对硫磷）和氨基甲酸酯类农药，还可以检测许多非神经毒性农药（莠去津、百草枯、氯菊酯），这与基于乙酰胆碱酯酶的生物传感器不同，因此它是检测多种农药的理想选择。由于线粒体对不同毒素产生的电化学输出不同，故使用单个传感器可区分农药。

　　近年来，农药残留的现场快检是食品安全和环境监测领域亟需解决的问题。为了减少对实验室大型设备的依赖，ePADs正顺应现代检测技术简捷化、多功能化的趋势迅猛发展，并为农药残留的现场POCT提供简便工具和安全可靠的技术平台。本文系统地总结了ePADs的制备过程以及针对农药的不同检测原理与芯片制备之间的联系。然而，ePADs的巨大应用潜力与现实使用情况之间依然存在鲜明的反差。面临的挑战主要包括：1）通用性，目前有机磷类农药和氨基甲酸酯类农药的检测大多基于酶抑制法，而有机氯类、拟除虫菊酯类和新烟碱类等农药的研究较少，因此研究一种通用的检测方法对简化ePADs制备过程及使用便捷性至关重要；2）样品基质效应，样品的基质可能会干扰检测的信号，开发更高效的纸上分离方法势在必行；3）在商业化道路上仍存在很多问题。实验室制备ePADs的过程中把握其质量相对容易，但商业化生产中质控相对较难。因此，未来仍需要做出更多的努力将其应用于实际农药残留检测。

　　本文《纸基微流控电化学芯片检测农药残留的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷15期252-262页。作者：李艳青，宗欣荣，陈思安，张敏。DOI:10.7506/spkx0915-133。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

　　为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。《食品科学》：西北农林科技大学张敏副教授等：纸基微流控电化学芯片检测农药残留的研究进展